三阴乳腺癌（Triple Negative Breast Cancer, TNBC）仍然是癌症治疗的难题。已有的研究表明，与Luminal A/B亚型或HER+亚型的乳腺癌患者相比，TNBC亚型的免疫原性更强，说明TNBC患者更可能从免疫治疗中受益，但免疫检查点抑制剂PD-1和PD-L1单抗对三阴乳腺癌的单药疗效较低【1】。这说明在三阴乳腺癌细胞与微环境相互作用的过程中，有许多因素制约着激活的T细胞对肿瘤的杀伤作用。对这些制约因素的深入挖掘并予以干预，可以极大提高T细胞免疫治疗的疗效，造福于患者。
细胞自噬（autophagy）贯穿于乳腺癌的演进过程中，它是一种进化上相对保守的蛋白质降解方式，主要用来降解长半衰期的蛋白和细胞器。但这种机制如何激活或限制免疫系统中T淋巴细胞对肿瘤细胞的攻击到现在为止依然没有被人们很好地理解。
在既往的研究中，中山大学肿瘤防治中心朱孝峰研究组和国外研究组曾分别报道了自噬基因ULK1与Beclin 1在乳腺癌中的蛋白表达水平低【2,3】，并且Beclin 1 mRNA水平的低下可成为TNBC患者独立的预测指标【4】。因此从一定程度上说，即使外界因素诱导乳腺癌细胞发生自噬，其细胞自噬的能力也是相对低下的，这种现象可能在TNBC患者中更明显。为了探讨自噬在T细胞攻击三阴乳腺癌细胞中所发挥的作用，作者展开了一系列的研究。
近日，华南肿瘤学国家重点实验室邓蓉/朱孝峰/唐军合作在Nature Communications发文题为Autophagy Deficiency Promotes Triple-Negative Breast Cancer Resistance to T Cell-Mediated Cytotoxicity by Blocking Tenascin-C Degradation的研究成果。该研究揭示自噬缺陷在三阴乳腺癌细胞实现逃逸T细胞免疫攻击中发挥了重要作用，并鉴定了Tenascin C是自噬缺陷导致T细胞免疫耐受的关键靶点，为三阴乳腺癌免疫耐受提供了新的治疗策略。
该研究首先明确了自噬缺陷的TNBC细胞对T细胞免疫杀伤的耐受现象。作者利用CRISPR-Cas9技术或RNAi技术敲除或干扰Atg5，Atg7 和Beclin 1等自噬相关基因的表达，构建自噬缺陷的TNBC细胞模型和小鼠移植瘤模型，观察激活的T淋巴细胞对自噬能力不同肿瘤细胞的杀伤作用。结果发现自噬缺陷的TNBC细胞能逃逸T细胞的免疫攻击，并观察到自噬缺陷的4T1肿瘤细胞成瘤能力显著增强，且浸润性T细胞的数量和活性显著降低。Tumor Immune Estimation Resource (TIMER) 网站生信数据分析也显示Atg5和Beclin 1的mRNA表达只在Basal-like 型乳腺癌中与TIL细胞的浸润成正相关。
为了找到与自噬缺陷相关的免疫抑制分子，作者结合SILAC蛋白标记技术与GSEA通路分析野生型和自噬缺陷型TNBC肿瘤细胞的蛋白表达差异，采用基因优化原则，筛选出受自噬调控的关键免疫抑制分子细胞外基质蛋白Tenascin-C (TNC)。进一步研究证实在自噬缺陷的TNBC细胞中，TNC蛋白水平显著上调；敲低TNC能回复自噬缺陷TNBC细胞对T细胞杀伤的敏感性，且对T细胞的增殖抑制作用减弱；而且TNC敲除后，自噬缺陷4T1肿瘤细胞移植瘤中浸润性T细胞的数量和活性显著降低，肿瘤生长速度显著减缓。
接下来作者阐明了TNC 蛋白在自噬缺陷的TNBC细胞中高表达的分子机制。自噬溶酶体途径是真核细胞重要的降解途径之一。选择性自噬-溶酶体降解途径异常与肿瘤的关系多有报道。在研究中，作者发现饥饿诱导自噬使野生型TNBC细胞的TNC蛋白水平明显下降，但自噬缺陷细胞中TNC降解被阻断。这提示TNC可能通过自噬溶酶体途径发生降解。进一步研究表明，E3泛素连接酶Skp2能介导TNC蛋白的Lys942和Lys1882位点发生K63型泛素化标记，促使TNC蛋白通过其FN3结构域与自噬受体蛋白P62的UBA（Ubiquitin-Associated binding domain）结构域在胞内发生结合。于是受体蛋白P62一方面将待降解的底物蛋白TNC拉到自噬泡附近，一方面通过其LIR（LC3-interacting region）基序与自噬泡上的ATG8/LC3结合，使TNC最终在溶酶体被选择性降解。而在自噬缺陷的TNBC细胞中，TNC 蛋白由于不能通过选择性自噬-溶酶体途径发生降解，导致其表达显著增高。
由于大多数TNBC患者对免疫检查点抑制剂无效或不敏感，因此提出新的免疫联合治疗策略具有重要意义。根据以上实验，作者提出猜想，自噬缺陷的TNBC细胞高表达TNC可能会抑制免疫检查点抑制剂的疗效。于是作者首先做了一系列生信分析及免疫组化分析，进一步明确TNC的临床应用价值。利用KM plotter数据库，作者发现在ER-的乳腺癌患者，尤其是basal-like型患者中，TNC的mRNA水平高表达，其无复发生存率（RFS），总生存期（OS），无远处转移生存期(DMFS)，进展后的生存期（PPS）更低。进一步的免疫组化分析显示，TNC蛋白高表达是TNBC患者不良的独立预后因素，且与LC3B表达呈负相关，与CD8+ T细胞肿瘤浸润呈显著负相关。接下来作者在自噬缺陷的TNBC细胞模型和小鼠移植瘤模型上联用了免疫检查点抑制剂和靶向TNC的治疗。结果发现， TNC单抗与anti-PD1/anti-PDL1联用比单药能显著增强T细胞对自噬缺陷TNBC细胞的杀伤作用；发现诱导性敲低TNC能够增强PD1单抗对自噬缺陷4T1移植瘤的治疗效果。
总的来说，该研究从自噬的角度探讨如何提高TNBC患者对T细胞免疫治疗的反应，为研究肿瘤自噬与免疫微环境的相互作用提供了新视野。该研究还明确靶向TNC能增强免疫检查点抑制剂对自噬缺陷肿瘤的疗效，为TNBC患者提供了具有应用前景的治疗策略。
华南肿瘤学国家重点实验室博士研究生李智玲、博士后张海亮、博士研究生黄昀为该论文共同第一作者；华南肿瘤学国家重点实验室邓蓉副教授、朱孝峰教授、唐军主任医师为该论文共同通讯作者。
原文链接https://www.nature.com/articles/s41467-020-17395-y
1 Keenan, T. E. & Tolaney, S. M.Role of Immunotherapy in Triple-Negative Breast Cancer. J Natl Compr Canc Netw 18,479-489, doi:10.6004/jnccn.2020.7554 (2020).2 Tang,J. et al. Low expression of ULK1 isassociated with operable breast cancer progression and is an adverse prognosticmarker of survival for patients. Breastcancer research and treatment134,549-560, doi:10.1007/s10549-012-2080-y (2012).3 Liang,X. H. et al. Induction of autophagyand inhibition of tumorigenesis by beclin 1. Nature 402, 672-676,doi:10.1038/45257 (1999).4Tang,H. et al. Decreased BECN1 mRNAExpression in Human Breast Cancer is Associated with Estrogen Receptor-NegativeSubtypes and Poor Prognosis. EBioMedicine2, 255-263,doi:10.1016/j.ebiom.2015.01.008 (2015).